一、概要

用來檢測呋喃唑酮代謝物的最常用方法是LC-UV，LC-MS和LC-MS/MS。酶聯免疫方法結合了色譜技術，采用AOZ衍生物的特異性抗體，具有很高的準確度和靈敏度，較低的操作技術要求和短暫的檢測時間，檢測樣本量大等特點在檢測中很好的表現出來。（本試劑盒的檢測時間為1.5小時。）

二、試驗原理

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在酶標板微孔條上預包被偶聯抗原，樣本中的殘留的AOZ經衍生化后和酶標板微孔條上預包被的偶聯抗原競爭抗呋喃唑酮代謝物的衍生物抗體，加入酶標二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物AOZ的含量成負相關，與標準曲線比較再乘以其對應的稀釋倍數，即可得出樣品中呋喃唑酮代謝物的殘留量。

三、適用范圍

可定性、定量檢測動物組織（雞、豬、牛等）、牛奶、蜂蜜和雞蛋樣本中的呋喃唑酮代謝物的殘留量。

四、交叉反應率

呋喃唑酮代謝物……………………………………   100%

呋喃它酮代謝物…………………………………小于 0.1%

呋喃妥因代謝物…………………………………小于 0.1%

硝基糠腙（呋喃西林）代謝物…………………小于0.1%

呋喃唑酮…………………………………………………16.3%

呋喃它酮………………………………………………小于1%

呋喃妥因………………………………………………小于1%

硝基糠腙（呋喃西林）………………………………小于1%

五、使用單位需自備的設備及試劑

設備：

┅┅微孔板酶標儀450nm/630nm

┅┅旋轉蒸發儀/氮氣吹干裝置

┅┅均質器

┅┅振蕩器

┅┅渦旋儀

┅┅離心機

┅┅天平：感量0.01g

┅┅刻度移液管：10ml

┅┅洗耳球

┅┅容量瓶： 100ml、1L

┅┅玻璃試管：10ml

┅┅聚苯乙烯離心管：2ml、10ml、50ml

┅┅微量移液器：單道 20ml～200ml、100ml～1000ml

多道 250ml

試劑：

┅┅乙酸乙酯（分析純）

┅┅正己烷（或正庚烷）（分析純）

┅┅三水合磷酸氫二鉀（分析純）

┅┅濃鹽酸

┅┅氫氧化鈉（分析純）

┅┅二水合亞硝基鐵氰化鈉（Na2Fe(CN)5·NO·2H2O）（分析純）（供奶、雞蛋樣用）

┅┅七水合硫酸鋅(ZnSO4·7 H2O) (分析純)（供奶、雞蛋樣用）

┅┅去離子水

六、提供的材料與試劑

1、96孔酶標板×1塊（包被有偶聯抗原）

2、標準液×6瓶：（1ml/瓶）

  0ppb,0.05ppb,0.15ppb,0.45ppb,1.35ppb,4.05ppb       3、高濃度標準品：（1ml/瓶） 100ppb

4、酶標二抗濃縮液      1.5ml …………………… 紅色帽

5、抗體濃縮液        0.8ml……………………綠色帽

6、底物液 A 液       7ml …………………… 白色帽

7、底物液 B 液       7ml …………………… 紅色帽

8、終 止 液          7ml …………………… 黃色帽

9、20×濃縮洗滌液    40ml………………………透明帽

10、2×濃縮復溶液    50ml……………………藍色帽

11、2-硝基苯甲醛       15.1mg……………………黑色帽

七、溶液的配制

配液1: 衍生化試劑

向裝有2-硝基苯甲醛的試劑瓶中加甲醇溶解定容至10ml（濃度為10mM）。

配液2: 0.1M磷酸氫二鉀溶液

            稱取22.8g三水合磷酸氫二鉀加去離子水溶解定容至1L。

配液3: C液（供奶樣、雞蛋用）：

0.36M亞硝基鐵氰化鈉（Na2Fe(CN)5·NO·2H2O）溶液

             稱取10.7g 亞硝基鐵氰化鈉加去離子水溶解定容至100ml

      D液（供奶樣、雞蛋用）：

1M硫酸鋅（ZnSO4·7H2O）溶液

             稱取28.8g 硫酸鋅用去離子水溶解定容至100ml

配液4: 1M鹽酸溶液      

量取8.3ml濃鹽酸加入到盛有去離子水的容器中定容至100ml。

配液5: 1M 氫氧化鈉溶液

        稱取4.0g氫氧化鈉加去離子水溶解定容至100ml。

配液6: 復溶工作液

用去離子水將2×濃縮復溶液按1：1體積比進行稀釋（1份2×濃縮復溶液+1份去離子水）用于抗體濃縮液、酶標二抗濃縮液的稀釋及提取樣本的復溶，復溶工作液在4℃環境可保存一個月。

配液7: 洗滌液工作液

用去離子水將20×濃縮洗滌液按1：19體積比進行稀釋（1份20×濃縮洗滌液+19份去離子水）用于酶標板的洗滌，洗滌工作液在4℃環境可保存一個月。

八、樣本前處理步驟

樣本處理前須知

處理任何樣本時，都必須注意：

（a）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。

（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否潔凈，必須使用潔凈實驗器具，以避免污染干擾實驗結果。

（c）衍生化試劑可于2-8℃保存半年。

（d）磷酸氫二鉀溶液可于2-8℃保存三個月

（e）鹽酸溶液可于室溫保存三個月

（f）氫氧化鈉溶液可于室溫保存三個月

（g）未處理的樣本冷凍保存。

（h）處理好的樣本可在2-8℃避光保存24小時。

（i）雞蛋樣本前處理過程中，50℃水浴2小時，中間每半小時必須用振蕩器劇烈振蕩1-2分鐘，它直接影響結果的準確性。

（一）肌肉、肝臟組織前處理方法

┅┅用均質器均質樣本；

┅┅接(四)的描述方法。

注：樣本應當在陰涼避光處冷藏保存

（二）牛奶前處理方法

┅┅取牛奶樣本，3000g以上，10℃離心10min，吸除上層脂肪；

┅┅取5ml去除脂肪牛奶樣本至10ml聚苯乙烯離心管中；

┅┅分別加入250ml C液和250ml D液（見配液3）；

┅┅用振蕩器充分振蕩混合，3000g以上，4~12 oC（39-54℉）離心10min。如果沒有恒溫離心機，則先將樣本降溫至大約8 oC（46℉），然后離心；

┅┅接(四)的描述方法

（三）蜂蜜前處理方法

┅┅稱取1.0±0.05g蜂蜜至50ml聚苯乙烯離心管中；

┅┅用4ml去離子水，用振蕩器振蕩至蜂蜜全部溶解；

┅┅加入0.5ml 1M鹽酸溶液（見配液4）和100ml衍生化試劑（見配液1），用振蕩器充分振蕩；

┅┅接(四)第二步描述方法（標 * 處）。

（四）接上面的方法

┅┅稱取1.0±0.05g均質后的組織樣本（肝樣/肉樣）、制備好的牛奶樣本上清液1.1ml（相當于1ml的奶樣），分別加入4ml的去離子水、0.5ml 1M 鹽酸溶液（見配液4）和100ml衍生化試劑（見配液1），用振蕩器充分振蕩2min；

*┅┅在37 oC過夜孵育（大約16h）；

┅┅分別加入5ml 0.1M 磷酸氫二鉀溶液（見配液2）、0.4ml 1M 氫氧化鈉溶液（見配液5）和5ml乙酸乙酯，用振蕩器劇烈振蕩30s；

┅┅3000g以上，室溫（20-25 oC/68-77℉）離心10min；

┅┅取2.5ml乙酸乙酯相至10ml干燥的玻璃試管中，于50～60℃氮氣流下吹干；

┅┅加入1ml正己烷（或正庚烷），用渦旋儀渦動30s，再加入1ml復溶工作液（見配液6），用渦旋儀渦動1min充分混勻；

┅┅3000g以上，室溫（20-25 oC/68-77℉）離心10min；

┅┅除去上層有機相，取下層水相50µl用于分析。

（五）雞蛋前處理方法

┅┅用均質器低速均質樣本(蛋黃或全蛋)；

┅┅稱取2.0±0.05g均質過的蛋樣本至10ml聚苯乙烯離心管中，分別加入4ml去離子水、0.5ml 1M 鹽酸溶液（見配液4）、200µl C液（見配液3），用振蕩器振蕩1min混勻；

┅┅加入200µl D液（見配液3），用振蕩器充分振蕩5min，3000g以上，室溫（20-25 oC/68-77℉）離心10min；

┅┅取全部上清液至15ml聚苯乙烯離心管中，加入200µl衍生化試劑（見配液1），用振蕩器充分振蕩，50℃水浴2h（中間每半小時用振蕩器劇烈振蕩1-2分鐘）；

┅┅分別加入5ml 0.1M 磷酸氫二鉀溶液（見配液2）、0.4ml 1M 氫氧化鈉溶液（見配液5）5ml乙酸乙酯，用振蕩器劇烈振蕩30s，3000g以上，室溫（20-25 oC/68-77℉）離心10min；

┅┅取2.5ml上層有機相，于50～60℃氮氣流下吹干；

┅┅加入1ml正己烷（或正庚烷），用渦旋儀渦動30s，再加入2ml復溶工作液（見配液6），用渦旋儀渦動1min充分混勻；（如出現乳化現象，請于60℃水浴中加熱5min，再重復離心）；

┅┅除去上層有機相，取下層水相50µl用于分析。

九、檢測步驟

測定前應須知：

1、使用之前將所有試劑和需用板條的溫度回升至室溫（20-25℃）。

2、使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。

3、在ELISA分析中的再現性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。

4、在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜封住微孔板。

 操作步驟：

1、將所需試劑從冷藏環境中取出，置于室溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、取出需要數量的微孔板，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

3、洗滌工作液在使用前也需回溫。

4、編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。

5、抗體工作液的稀釋：將抗體濃縮液用復溶工作液按照1：10體積比進行稀釋（1份抗體濃縮液加入10份復溶工作液）。

6、加標準品/樣本：加標準品/樣本50ml到對應的微孔中，然后加入抗體工作液50ml/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環境中反應30min。

7、洗板：小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，用洗滌工作液（見配液7）250ml/孔，充分洗滌4－5次，每次間隔10s，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破）。

8、酶標二抗工作液的稀釋：將酶標二抗濃縮液用復溶工作液按照1：10體積比進行稀釋（1份酶標二抗濃縮液加入10份復溶工作液）。

9、加酶標二抗：加入酶標二抗100ml/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環境中反應30min，取出重復洗板步驟7。

10、顯色：加入底物液A液50ml/孔，再加底物液B液50ml/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環境中反應15min（見注意事項8）。

11、測定：加入終止液50ml/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，請在5min內讀完數據），測定每孔OD值。(若無酶標儀，則不加終止液用目測法可進行判定)。

十、結果判定

結果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與呋喃唑酮代謝物的含量成負相關。

1、用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出其濃度范圍(ppb)。假設樣本1的吸光度值為0.310，樣本2的吸光度值為0.820，標準液吸光度值分別是：0ppb為2.104；0.05ppb為1.224；0.15ppb為0.859；0.45ppb為0.522； 1.35ppb為0.270；4.05ppb為0.129。則樣本1的濃度范圍是0.45ppb-1.35ppb再乘以其對應的稀釋倍數即可得出樣本中呋喃唑酮代謝物殘留的濃度范圍；樣本2的濃度范圍是0.15ppb-0.45ppb再乘以其對應的稀釋倍數即可得出樣本中呋喃唑酮代謝物殘留的濃度范圍。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標準（0標準）的吸光度值，再乘以100%，即

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0—0ppb標準溶液的平均吸光度值

（2）標準曲線的繪制與計算

以標準品百分吸光率為縱坐標，以呋喃唑酮代謝物標準品濃度（ppb）的半對數為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中呋喃唑酮代謝物的實際濃度。

若利用試劑盒專業分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。（歡迎來電索�。�

樣本稀釋倍數

肌肉、肝臟組織樣品稀釋倍數：2

奶樣樣品稀釋倍數：2

蜂蜜樣品的稀釋倍數：2

雞蛋樣品的稀釋倍數：2  

十一、檢測方法靈敏度、準確度、精密度

試劑盒靈敏度：0.05ppb

樣本最低檢測限：

組織、蜂蜜 ……………………………………………0.1ppb

雞蛋、奶樣………………………………………………0.1ppb

準確度：

肌肉、肝臟組織 ……………………………… 75±15%

蜂蜜 …………………………………………… 90±15%

雞蛋 …………………………………………… 90±20%

奶樣………………………………………………… 90±10%

精密度：

試劑盒的變異系數均小于10%

十二、注意事項

1、室溫低于20℃或試劑及樣本沒有回到室溫（20-25℃）會導致所有標準的OD值偏低。

2、在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會出現標準曲線不成線性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。

3、每加一種試劑前需要將其搖勻。

4、反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、不要使用過了有效日期的試劑盒；也不要使用過了有效期的試劑盒中的任何試劑，摻雜使用過了有效期的試劑盒會引起靈敏度的降低；不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。

6、儲存條件

保存試劑盒于2-8℃，不要冷凍，將不用的微孔板放進自封袋重新密封。標準物質和無色的發色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、試劑變質的跡象

發色試劑有任何顏色表明發色劑變質，應當棄之。0標準的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5 ）時，表示試劑可能變質。

8、在加入底物液A液和底物液B液后，一般顯色10-15min即可。若顏色較淺，可延長反應時間到20min（或更長），但不得超過30min。反之，則減短反應時間。

9、該試劑盒最佳反應溫度為25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發生變化。

十三、貯藏條件及保存期

     貯藏條件：保存試劑盒于2~8℃。