DNA的合成、純化及鑒定

　　由于現代科學技術的發(fā)展，DNA合成已廣泛采用DNA自動合成儀，僅有少數特殊情況下采用人工合成。目前，主要有ABI(Applied Biosystem Inc.) 。Pharmacia、Backman等幾家公司生產DNA/RNA合成儀，其中以ABI公司的儀器占我國及世界市場的80～90%。由于合成技術的現代化，人們已從繁重的勞動中得到解脫。輸入合成儀的DNA序列，可以在數小時之內得到完成。我們所要做的工作只是合成柱取下，進行DNA切落和去保護基以及純化，并進行量鑒定和計算合成率。

1. DNA合成儀的操作（略）

2. DNA原切落及去保護
　　取下DNA合成柱，置適量濃氨水(氫化銨，28%)中浸泡，一般為1ml氫氧化銨密封后55℃保溫：～15小時，或70℃保溫2小時，使合成的寡核苷酸片段從載體上切落并去除β-腈乙基磷酸保護基。

3.寡核苷酸片段的純化
1）.NAP柱純化：由Pharmacia公司生產，主要成分為Sephadex G-25，經特殊處理后裝成的不同體積的小柱常用的有NAP-10。含寡核苷酸片段的氨水溶液，調整體積為1ml加樣于NAP-10柱上(使用前，以15ml雙蒸水平衡柱子)以1ml雙蒸水洗脫，收集洗脫下的液體，即為純化的寡核苷酸，NAP-10柱可以純化長度在10mer以上的寡核苷酸，產率在90%以上。經NAP-10柱純化后樣品中鹽的含量少于3%，完全可以滿足實驗的需要。

2）.丙烯酰胺凝膠電泳純化，從合成柱上洗脫的寡核苷酸片段，冰凍、干燥、去氨水，溶于適量水中后，占樣于15～20%丙烯酰胺凝膠制備膠上，按10V/cm條件電泳，過夜。電泳完畢后，取下凝膠于EB染色后觀察，或直接將含寡核苷酸片段的凝膠置于硅膠熒光板上(CMC板)紫外線燈下，根據分子量的標準切下所需的區(qū)段
(呈黑色)，將膠塊置少量緩沖液(10mmol/L Tris? HCl，pH8.0，1mmol/L EDTA 300mmol/LNaCl)，搗碎膠塊，25～42℃浸泡過夜(4～24小時)，或將膠塊置于有少量緩沖液的透析袋中，通電下，寡核苷酸片段即進入透折袋中。洗脫的寡苷酸核片段以酒精沉淀、洗滌，真空抽干后即可應用。

浸泡法簡單，成本低，易操作。電泳法較快，回收產率高，但需鑒定。此外還有HPLC(高效液相層析)，及寡核苷酸純合柱(OPC，ABI生產)等方法可以純化寡核苷酸片段。可以根據手頭的材料，儀器及使用習慣而加以選擇。

4.寡核苷酸片段的鑒定
　　可以采用PAGE、HPLC、FPLC等方法對合成的寡核苷酸進行鑒定。對于10～100mer的寡核苷酸，可以用20%濃度的丙烯酰胺凝膠電脈，觀察電泳區(qū)帶即可判斷合成片段的純度及片段大小。如果結合5′或3′末端核素標記放射自顯影技術則結果更加可靠。采用FPLC和HPLC鑒定合成片段的純度，速度快，精確度高，但需昂貴的儀器設備。合成片段最精確的鑒定方法是采用Maxam-Gilbert化學法測定核苷酸序列。

5.合成產物中DNA含量的測定
　　4種堿基的平均最大吸收波長為260nm。一般選用該波長測定DNA含量。測定前，稀釋樣品，使光吸收在0.2～1.2OD范圍內。在石英比色杯中測定樣品溶液光密度。

表14-1 合成寡核苷酸片段粗產量

產量=OD₂₆₀×25=OD₂₆₀實測值×稀釋倍數×體積×25(m g/ml)一般認為對單鏈寡核苷酸片段，1OD₂₆₀=25m g/ml。
不同規(guī)格合成柱產量均不一樣。