RAPD操作要點(diǎn)

　　一、 材料
　　不同來(lái)源的DNA(50ng/ul)。
　　二、設(shè)備
　　PCR儀，PCR管或硅化的0.5ml eppendorf管，電泳裝置。
　　三、試劑
　　1、隨機(jī)引物(10mer) (5umol/L)：購(gòu)買成品。
　　2、Taq酶：購(gòu)買成品。
　　3、10xPCR 緩沖液：配方見第八章。
　　4、MgCl2 ：25mmol/L。
　　5、dNTP：每種2.5mmol/L。
　　四、操作步驟：
　　1. 在25ul反應(yīng)體系中,加入
　　　　模板DNA 1ul (50ng)
　　　　隨機(jī)引物 1ul (約5pmol)
　　　　10xPCR Buffer 2.5ul
　　　　MgCl2 2ul
　　　　dNTP 2ul
　　　　Taq酶 1單位（U）
　　　　加ddH2O 至 25ul
　　混勻稍離心, 加一滴礦物油。
　　2. 在加熱至90℃以上的PCR儀中預(yù)變性94℃ 2分鐘, 然后循環(huán): 94℃ 1分鐘， 36℃ 1分鐘， 72℃ 1分鐘，共40輪循環(huán)。
　　3. 循環(huán)結(jié)束后, 72℃ 10分鐘，4℃保存。
　　4. 取PCR產(chǎn)物15ul加3ul上樣緩沖液(6x)于2% 瓊脂糖膠上電泳, 穩(wěn)壓50-100Ｖ（電壓低帶型整齊， 分辨率高）。
　　5. 電泳結(jié)束，觀察、拍照。
　　[注意] 1、電泳時(shí)一般RAPD帶有5-15條, 大小0.1-2.0kb。
　　　　　　2、 特異性的DNA帶可以克隆作為一個(gè)新的分子標(biāo)記應(yīng)用。