原位雜交操作流程

1、使用地高辛標記的核酸探針進行石蠟切片的RNA原位雜交第一天
1） 二甲苯于37℃脫蠟2次，每次15分鐘；
2） 無水乙醇浸泡2次，每次3分鐘；
3） 95%乙醇浸泡2次，每次3分鐘；
4） PBS清洗3分鐘；
5） 2%焦碳酸二乙酯室溫下浸泡10分鐘；
6） PBS清洗10分鐘；
7） 加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育15分鐘；
8） PBS清洗2次，每次3分鐘；
9） 0.2N的HCl孵育30分鐘；
10）PBS清洗2次，每次3分鐘；
11）0.25%無水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分鐘；
12）PBS清洗2次，每次5分鐘；
13）預雜交緩沖液孵育30分鐘；
14）準備核酸探針混合物：使用預雜交緩沖液稀釋探針，85℃加熱5分鐘，置于冰塊中10分鐘；
15）雜交；第二天
16）將玻片置于SSC中2次，每次5分鐘以去除封片；
17）PBS清洗3分鐘；
18）RNA酶A溶液中（或0.1-1ng/mlPBS中），37℃孵育30分鐘；
19）PBS清洗5分鐘；
20）室溫，2×SSC清洗10分鐘；
21）37℃，1×SSC清洗10分鐘；
22）37℃，0.5×SSC清洗10分鐘；
23）緩沖液A孵育10分鐘；
24）緩沖液A（1%正常綿羊血清和0.03%三重氫核X-100）孵育30分鐘；
25）加入抗地高辛抗體（1/200的上述緩沖液，來自Boehringer Mannheim），37℃孵育3 小時；
26）緩沖液A清洗2次，每次10分鐘；
27）緩沖液B清洗2次，每次5分鐘；
28）制成NBT/BCIP暗處保存30-60分鐘，顯微鏡下進行觀察，如果背景尚佳，顯色時間可延長到16小時；
29）停止緩沖液B的反應，用水進行簡單的清洗；
30）固紅，脫水以及封片進行核的復染。
2、使用地高辛標記的寡核苷酸探針進行石蠟切片的原位DNA雜交第一天
1） 二甲苯于37℃脫蠟2次，每次15分鐘；
2） 無水乙醇浸泡2次，每次5分鐘；
3） 95%乙醇浸泡2次，每次5分鐘；
4） PBS清洗5分鐘；
5） 2%焦碳酸二乙酯室溫下浸泡10分鐘；
6） PBS清洗5分鐘；
7） 加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育10分鐘；
8） PBS清洗2次，每次5分鐘；
9） 0.2N的HCl孵育30分鐘；
10）PBS清洗2次，每次5分鐘；
11）0.25%無水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分鐘；
12）PBS清洗5分鐘；
13）預雜交緩沖液孵育30分鐘；
14）準備寡核苷酸探針混合物：使用預雜交緩沖液稀釋探針；
15）雜交；第二天
16）將玻片置于SSC中以去除封片；
17）室溫，2×SSC清洗10分鐘；
18）37℃，1×SSC清洗10分鐘；
19）37℃，0.5×SSC清洗10分鐘；
20）緩沖液A孵育10分鐘；
21）緩沖液A孵育30分鐘；
22）加入抗地高辛抗體37℃孵育3小時；
23）緩沖液A清洗2次，每次5分鐘；
24）緩沖液B清洗2次，每次5分鐘；
25）制成NBT/BCIP暗處保存30-60分鐘，顯微鏡下進行觀察，如果背景尚佳，顯色時間可長到16小時；
26）停止緩沖液B的反應，用水進行簡單的清洗；
27）固紅，脫水以及封片進行核的復染。