雙鏈DNA探針隨機引物合成法

    隨機引物合成雙鏈探針是使寡核苷酸引物與DNA模板結合,在Klenow酶的作用下,合成DNA探針。合成產物的大小、產量、比活性依賴于反應中模板、引物、dNTP和酶的量。通常,產物平均長度為400-600個核苷酸。利用隨機引物進行反應的優點是：(1)Klenow片段沒有5'→3'外切酶活性,反應穩定,可以獲得大量的有效探針。(2)反應時對模板的要求不嚴格,用微量制備的質粒DNA模板也可進行反應。(3)反應產物的比活性較高,可達4×109 cpm/μg探針。(4)隨機引物反應還可以在低熔點瓊脂糖中直接進行。
　　材料：待標記的DNA片段。
　　設備：高速臺式離心機，恒溫水浴鍋等。
　　試劑：
　　(1)隨機引物（隨機六聚體或斷裂的鮭魚精子DNA）。
　　(2)10×隨機標記緩沖液：900mmol/L HEPES (pH6.6); 10mmol/L MgCl2。
　　(3)Klenow片段。
　　(4)20mmol/L DTT。
　　(5)未標記的dNTP溶液：dGTP、dCTP和dTTP溶液，各5mmol/L。
　　(6)[α-32 P] dATP：比活性>3000Ci/mmol, 10μCi/μl。
　　(7)緩沖液A：50mmol/L Tris·Cl （pH7.5）; 50mmol/L NaCl; 5mmol/L EDTA （pH8.0）; 0.5% SDS。
　　操作步驟:
　　(1) 200ng雙鏈DNA(1μl)和7.5ng隨機引物(1μl)混合后置于eppendorf管內,水浴煮沸5分鐘后，立即置于冰浴中1分鐘。
　　(2) 與此同時,盡快在一置于冰浴中的0.5ml eppendorf管內混合下列化合物:
　　　　20mmol/L DTT 1μl
　　　　未標記的dNTP溶液 1μl
　　　　10×隨機標記緩沖液 1μl
　　　　[α-32 P] dATP(比活性>3000Ci/mmol; 10μCi/μl) 3μl
　　　　ddH2O 1μl
　　(3) 將步驟(1)eppendorf管中的溶液移到步驟(2)管中。
　　(4) 加入5單位(約1μl) Klenow片段, 充分混合,在微型離心機中以12000g離心1-2秒, 使所有溶液沉于試管底部,在室溫下保溫3-16小時。
　　(5) 在反應液中加入10μl緩沖液A后,將放射性標記的探針保存在-20℃下備用。同時計算放射比活性。