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    質粒DNA的提取及鑒定

    放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-02

      1.收獲細菌

      (1)將2ml含相應抗生素的LB液體培養(yǎng)基加入到通氣良好的15ml的試管中,接入一單菌落,于37℃劇烈振蕩培養(yǎng)過夜。
      (2)將1.5ml培養(yǎng)物倒入1.5ml離心管中,用臺式離心機于4℃以12000g離心5min,將剩余的培養(yǎng)物貯存于4℃。
      (3)吸盡培養(yǎng)液,使細菌沉淀盡可能干燥。

      2.堿裂解法小量抽提質粒

      (1)將細菌沉淀[上述步驟(3)所得]重懸于100μl預冷的溶液Ⅰ(50mmol/L葡萄糖,25mmol/l Tris –HCl pH8.0, 10mmol/L EDTA)中,劇烈振蕩。
      (2)加200μl新配制的溶液Ⅱ(0.2mol/l NaOH, 1%SDS),緩和振蕩,水浴5min。
      (3)加150μl預冷溶液Ⅲ(50mol/L KAC 60ml, 冰乙酸11.5ml,水28.5ml),緩和振蕩,冰浴5min。
      (4)4℃以12000g離心5min,將上清轉移到另一離心管中。
      (5)可作不可作:加等量飽和酚,氯仿,振蕩混勻,重復2,(4)。
      (6)用2倍體積無水乙醇室溫沉淀雙鏈DNA,振蕩混合,于室溫放置2min。
      (7)4℃以12000g離心5min。
      (8)小心吸盡上清液,將離心管倒置于一張紙巾上,再將附于管壁的液滴除盡。
      (9)用75%乙醇于4℃洗滌DNA,同上離心去上清真空抽干。
      (10)加50μl的1×TE(含20μg/ml無DNA酶的胰RNA酶),振蕩,貯存于-20℃。


     
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