質粒載體的粘端DNA連接

(１）用適當的限制酶消化質粒和外源ＤＮＡ。如有必要，可用凝膠電泳分離片段并（或）用堿性磷酸酶處理質粒ＤＮＡ。通過酚：氯仿抽提和乙沉淀來純化ＤＮＡ，然后用TE(pH7.6)溶液使其濃度為100/ml。
(２）按如下所述設立連接反應混合物：
a．將0.1μl載體ＤＮＡ轉移到無菌微量離心管中，加等摩爾量的外源ＤＮＡ。
b．加水至7.5μl，于45℃加溫５分鐘以使重新退炎的粘端解鏈，將混合物冷卻到０℃。
c．加入：10xT4噬菌體ＤＮＡ連接酶緩沖液 １μl
Ｔ４噬菌體ＮＤＡ連接酶 0.1Weiss單位
５mmol/L ATP 1μl
于16℃溫育１－４小時
10xT4噬菌體ＤＮＡ連接酶緩沖液
200mmol/L同Tris.Cl(pH7.6)
50mmol/K MgCl2
50mmol/L二硫蘇糖醇
500μg/ml牛血清白蛋白（組分Ｖ.Sigma產品）（可用可不用）
該緩訓液應分裝成小份，貯存于－20℃。
另外，再設立兩個對照反應，其中含有（１）只有質粒載體；（２）只有外源ＤＮＡ片段。如果外源ＤＮＡ量不足，每個連接反應可用50-100ng質粒ＤＮＡ，并盡可能多加外源ＤＮＡ，同時保持連接反應體積不超過10μl。可用至少３種不同方法來測定Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶的活性。大多數制造廠商（除New England Biolabs公司外）現在都用Weiss等，１1968)對該酶進行標化。１個Weiss單位是指在37℃下20分釧內催化１mmol32P從焦磷酸根置換到[γ,β-32P]ATP所需酶時，１個Weiss單位相當于0.2個用外切核酸酶耐受試驗來定義的單位（Modrich和Lehman,1970)或者60個粘端單位（如Ｎew England Biolabs公司所定義）。因此，0.015Ｗeiss單位的Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶在16℃下30分鐘內可使50％的λ噬菌體HindⅢ片段（5μg）得以連接。在本書中，Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶一律用Weiss單位表示。\par 目前提供的Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶均為濃溶液（1-5單位/μl），可用20mmol/L Tris.Cl(pH7.6)、60mmol/L KCl、5mmol/L二硫蘇糖醇、500μg/ml牛血清白蛋白、50％甘稀釋成100單位/ml的濃度置存。處于這種濃度并在這種緩沖液中的Ｔ４噬體ＤＮＡ連接酶于-20℃保存３個月可保持穩定。
(３）每個樣品各取１－２μl轉化大腸桿菌感受態細胞。