Sanger雙脫氧法測序原理

DNA的復制需要：DNA聚合酶，單鏈DNA模板，帶有3'-OH末端的單鏈寡核苷酸引物，4種dNTP（dATP、dGTP、dTTP和dCTP）。聚合酶用模板作指導，不斷地將dNTP加到引物的3'-OH末端，使引物延伸，合成出新的互補DNA鏈。如果加入一種特殊核苷酸，雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP），因它在脫氧核糖的3’位置缺少一個羥基，故不能同后續的dNTP形成磷酸二酯鍵。如，存在ddCTP、dCTP和三種其他的dNTP（其中一種為α-32P標記）的情況下，將引物、模板和DNA聚合酶一起保溫，即可形成一種全部具有相同的5'-引物端和以ddC殘基為3’端結尾的一系列長短不一片段的混合物。經變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離制得的放射性自顯影區帶圖譜將為新合成的不同長度的DNA鏈中C的分布提供準確信息，從而將全部C的位置確定下來。類似的方法，在ddATP、ddGTP和ddTTP存在的條件下，可同時制得分別以ddA、ddG和ddT殘基為3‘端結尾的三組長短不一的片段。將制得的四組混合物平行地點加在變性聚丙烯酰胺凝膠電泳板上進行電泳，每組制品中的各個組分將按其鏈長的不同得到分離，制得相應的放射性自顯影圖譜。從所得圖譜即可直接讀得DNA的堿基序列.