凝膠層析又稱為分子篩層析或凝膠過濾。具有分子篩作用的物質(zhì)很多，如浮石、瓊脂、瓊脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝膠等。以葡聚糖凝膠應(yīng)用最廣，商品名是sephadex型號很多，從G10到G200，它的主要應(yīng)用范圍是：①分級分離各種抗原與抗體；②去掉復(fù)合物中的小分子物質(zhì)。如除鹽、熒光素和游離的放射性同位素以及水解的蛋白質(zhì)碎片；③分析血清中的免疫復(fù)合物；④分子量的測定。
（一）原理
凝膠是一種多孔性的不帶表面電荷的物質(zhì)，當(dāng)帶有多種成分的樣品溶液在凝膠內(nèi)運動時，由于它們的分子量不同而表現(xiàn)出速度的快慢，在緩沖液洗脫時，分子量大的物質(zhì)不能進入凝膠孔內(nèi)，而在凝膠間幾乎是垂直的向下運動，而分子量小的物質(zhì)則進入凝膠孔內(nèi)進行“繞道”運行，這樣就可以按分子量的大小，先后流出凝膠柱，達到分離的目的。
（二）葡聚糖凝膠的種類與性能
葡聚糖又名右旋糖酐，在它們的長鏈間以三氯環(huán)氧丙烷交聯(lián)劑交聯(lián)而成。葡聚糖凝膠具有很強的吸水性，交聯(lián)度大，吸水性小，相反交聯(lián)度小，吸水性大。商品名以SephadexG表示，G值越小，交聯(lián)度越大，吸水性越小，G值越大，交聯(lián)度越小，吸水性就越大，二者呈反比關(guān)系，G值大約為吸水量的10倍。由此可以根據(jù)床體積而估算出葡聚糖凝膠干粉的用量。
表 Sephadex1的種類與特性
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型號
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分離范圍
（分子量）
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吸水量
（ml/g）
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最小溶脹時（h）
20℃～25℃ 100℃
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床體積（ml）/干凝膠（mg）
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G10
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＜700
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1.0±0.1
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3 1
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2~3
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G15
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＜1 500
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1.5±0.2
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3 1
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2.5~3.5
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G25
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＜5 000
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2.5±0.2
|
3 1
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4~6
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G50
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1500～20 000
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8.0±0.3
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3 1
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9~11
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G75
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3 000～70 000
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7.5±0.5
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24 1
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12~15
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G100
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4 000～15 000
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10.0±1.0
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72 1
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15~20
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G150
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5 000～800 000
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15.0±1.5
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72 1
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20~30
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G200
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5 000～30 0000
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20.0±2.0
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72 1
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30~40
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G25、G50有四種顆粒型號：粗（100µ~300µ）、中（50µ~150µ）、細（20µ~80µ）和超細（10µ~40µ）。G75～G200又有兩種顆粒型號：中（40µ～120µ），超細（10µ～40µ）。顆粒越細，流速越慢，分離效果越好。
表 DEAE－纖維素與Sephadex1比較
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項 目
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DEAE纖維素
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Sephadex
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交換量
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小
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較大
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非特異性吸附
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較大
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小
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分離純度
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較好
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好
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分離時間
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較粗
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較長
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應(yīng)用范圍
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較窄
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較寬
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預(yù)處理
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繁瑣
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方便
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（三）試驗方法
1．凝膠的選擇 根據(jù)層析物質(zhì)分子量的大小選擇不同型號的凝膠，如除鹽和除游離的熒光素，則可選用粗、中粒度的G28或G500，G250多用于分離蛋白質(zhì)單體，G200多用于分離蛋白質(zhì)凝膠聚合體等。
2．凝膠的預(yù)處理 稱取適量的凝膠加入過量的緩沖液在冰箱（或室溫）中充分膨脹，或在沸水中煮，膨脹時間應(yīng)根據(jù)不同型號的凝膠而定。
表 凝膠量與型號和層析柱大小與規(guī)格及凝膠用量
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層析柱規(guī)格
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凝膠的規(guī)格和用量（g）
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直徑（cm）
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高（cm）
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容量（ml）
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G25
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G50
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G100
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G200
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0.9
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15
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9.5
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2.5
|
1
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0.6
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0.3
|
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0.9
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30
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19
|
5
|
2
|
1.2
|
0.6
|
|
0.9
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60
|
38
|
10
|
4
|
2.5
|
1.2
|
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1.6
|
20
|
40
|
10
|
4
|
2.5
|
1.2
|
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1.6
|
40
|
80
|
20
|
8
|
5.0
|
2.4
|
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1.6
|
70
|
140
|
35
|
14
|
9.0
|
4.4
|
|
1.6
|
100
|
200
|
50
|
20
|
12.5
|
6
|
|
2.6
|
40
|
210
|
50
|
20
|
12
|
7
|
|
2.6
|
70
|
370
|
90
|
35
|
20
|
12
|
|
2.6
2.6
|
100
60
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530
1 000
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130
250
|
50
110
|
30
70
|
17
35
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為使粒子均勻一致需進行浮選，即加入凝膠粒子后，輕輕攪拌，靜置20min，傾去沉淀的粒子，如此反復(fù)數(shù)次即可。
3．裝柱 層析柱的選擇一般根據(jù)分離樣品的種類和樣品的數(shù)量而定。純化蛋白質(zhì)時，柱床體積應(yīng)為樣品體積的25～100倍。去鹽、游離熒光素約為樣品體積的4～10倍。柱太短，影響分離效果。柱長一些，分離效果好，但柱太長，則延長分離時間，樣品也稀釋過度。層析柱的內(nèi)徑也要選擇適當(dāng)。內(nèi)徑過細，會發(fā)生“器壁效應(yīng)”，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影響分離效果。所以層析柱的內(nèi)徑和高度應(yīng)有一定的比例。對于除鹽來說應(yīng)為1︰5～1︰25；對于純化蛋白質(zhì)來說應(yīng)為1︰20～1︰100。
裝柱過程基本同離子交換層析柱。
4．加樣與洗脫 樣品體積不宜過多，最好為床體積的1％～5%，最多不要超過10%。樣品濃度也不宜過大，濃度過大粘度大，分離效果差，一般不超過4%。
洗脫液應(yīng)與膨脹一致，否則更換溶劑，凝膠體積會發(fā)生變化，影響分離效果。洗脫液要有一定的離子強度和pH值。分離血清蛋白常用0.02～0.1Mol/L pH 6.9~8.0的PBS液（0.14Mol/L NaCl）和0.1Mol/L pH8.0Tris-HCl緩沖鹽溶液（0.14Mol/L NaCl）。
5．洗脫液收集 同離子交換層析。
6．凝膠柱的重復(fù)使用與保存 當(dāng)樣品的各組分全部洗脫下來之后，即可加入新的樣品，繼續(xù)使用。保存方法有三種：
⑴ 在液相中保存最方便，即于凝膠懸液中加入防腐劑（一般為0.02%N2N3或0.002%洗必泰）或高壓滅菌后4℃保存。此法至少可以保存半年以上。
⑵ 用完后，以水沖洗，然后用60%~70%酒精液沖洗，凝膠體積縮小，即在半收縮狀態(tài)下保存。
⑶ 長期不用者，最好以干燥狀態(tài)保存，即水洗凈后，用含乙醇的水洗，逐漸加大乙醇用量，最后用95%的乙醇洗，可全部去水，再用乙烯去除乙醇，抽濾干，于60℃~80℃干燥后保存。
