免疫膠體金(Immune colloidal gold)

原理

免疫膠體金技術是以膠體金作為示蹤標志物應用于抗原抗體的一種新型的免疫標記技術。膠體金是由氯金酸（HAuCl₄）在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，稱為膠體金。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負電荷，可與蛋白質分子的正電荷基團形成牢固的結合，由于這種結合是靜電結合，所以不影響蛋白質的生物特性。

膠體金除了與蛋白質結合以外，還可以與許多其它生物大分子結合，如SPA、PHA、ConA等。根據膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應，加上結合物的免疫和生物學特性，因而使膠體金廣泛地應用于免疫學、組織學、病理學和細胞生物學等領域。

膠體金的制備

根據不同的還原劑可以制備大小不同的膠體金顆粒。常用來制備膠體金顆粒的方法如下。

1．枸櫞酸三鈉還原法

（1）10nm膠體金粒的制備：取0.01％HAuCl₄水溶液100ml，加入1％枸櫞酸三鈉水溶液3ml，加熱煮沸30min，冷卻至4℃，溶液呈紅色。

（2）15nm膠體金顆粒的制備：取0.01％HAuCl₄水溶液100ml，加入1％枸櫞酸三鈉水溶液2ml，加熱煮沸15min～30min，直至顏色變紅。冷卻后加入0.1Mol/L K₂CO₃0.5ml，混勻即可。

（3）15nm、18nm～20nm、30nm或50nm膠體金顆粒的制備：取0.01％HAuCl₄水溶液100ml，加熱煮沸。根據需要迅速加入1％枸櫞酸三鈉水溶液4ml、2.5ml、1ml或0.75ml，繼續(xù)煮沸約5min，出現橙紅色。這樣制成的膠體金顆粒則分別為15nm、18～20nm、30nm和50nm。

2．鞣酸—枸櫞酸鈉還原法

A液：1％HAuCl₄水溶液1ml加入79ml雙餾水中混勻。

B液：1％枸櫞酸三鈉4ml，1％鞣酸0.7ml，0.1Mol/L K₂CO₃液0.2ml，混合，加入雙餾水至20ml。

將A液、B液分別加熱至60℃，在電磁攪拌下迅速將B液加入A液中，溶液變藍，繼續(xù)加熱攪拌至溶液變成亮紅色。此法制得的金顆粒的直徑為5nm。如需要制備其它直徑的金顆粒，則按表所列的數字調整鞣酸及K₂CO₃的用量。

鞣酸—枸櫞酸鈉還原法試劑配制表

3．制備高質量膠體金的注意事項

（1）玻璃器皿必須徹底清洗，最好是經過硅化處理的玻璃器皿，或用第一次配制的膠體金穩(wěn)定的玻璃器皿，再用雙餾水沖洗后使用。否則影響生物大分子與金顆粒結合和活化后金顆粒的穩(wěn)定性，不能獲得預期大小的金顆粒。

（2）試劑配制必須保持嚴格的純凈，所有試劑都必須使用雙餾水或三餾水并去離子后配制，或者在臨用前將配好的試劑經超濾或微孔濾膜（0.45µm）過濾，以除去其中的聚合物和其它可能混入的雜質。

（3）配制膠體金溶液的pH以中性（pH7.2）較好。

（4）氯金酸的質量要求上乘，雜質少。最好是進口的。

（5）氯金酸配成1％水溶液在4℃可保持數月穩(wěn)定，由于氯金酸易潮解，因此在配制時，最好將整個小包裝一次性溶解。

膠體金標記蛋白的制備

膠體金對蛋白的吸附主要取決于pH值，在接近蛋白質的等電點或偏堿的條件下，二者容易形成牢固的結合物。如果膠體金的pH值低于蛋白質的等電點時，則會聚集而失去結合能力。除此以外膠體金顆粒的大小、離子強度、蛋白質的分子量等都影響膠體金與蛋白質的結合。

1．待標記蛋白溶液的制備 將待標記蛋白預先對0.005Mol/L pH7.0 NaCl溶液中4℃透析過夜，以除去多余的鹽離子，然后100 000g4℃離心1h，去除聚合物。

2．待標膠體金溶液的準備 以0.1Mol/L K₂CO₃或0.1Mol/L HCl調膠體金液的pH值。標記IgG時，調至9.0；標記McAb時,調至8.2；標記親和層析抗體時，調至7.6；標記SPA時，調至5.9～6.2；標記ConA時，調至8.0；標記親和素時，調至9～10。

由于膠體金溶液可能損壞pH計的電板，因此，在調節(jié)pH時，采用精密pH試紙測定為宜。

3．膠體金與標記蛋白用量之比的確定

（1）根據待標記蛋白的要求，將膠體金調好pH之后，分裝10管，每管1ml。

（2）將標記蛋白（以IgG為例）以0.005Mol/L pH9.0硼酸鹽緩沖液做系列稀釋為5µg/ml～50µg/ml，分別取1ml，加入上列金膠溶液中，混勻。對照管只加1ml稀釋液。

（3）5min后，在上述各管中加入0.1ml 10％NaCl溶液，混勻后靜置2h，觀察結果。

（4）結果觀察，對照管（未加蛋白質）和加入蛋白質的量不足以穩(wěn)定膠體金的各管，均呈現出由紅變藍的聚沉現象；而加入蛋白量達到或超過最低穩(wěn)定量的各管仍保持紅色不變。以穩(wěn)定1ml膠體金溶液紅色不變的最低蛋白質用量，即為該標記蛋白質的最低用量，在實際工作中，可適當增加10％～20％。

4．膠體金與蛋白質（IgG）的結合 將膠體金和IgG溶液分別以0.1Mol/L K₂CO₃調pH至9.0，電磁攪拌IgG溶液，加入膠體金溶液，繼續(xù)攪拌10min，加入一定量的穩(wěn)定劑以防止抗體蛋白與膠體金聚合發(fā)生沉淀。常用穩(wěn)定劑是5％胎牛血清（BSA）和1％聚乙二醇（分子量20KD）。加入的量：5％BSA使溶液終濃度為1％；1％聚乙二醇加至總溶液的1／10。

5．膠體金標記蛋白的純化

（1）超速離心法：根據膠體金顆粒的大小，標記蛋白的種類及穩(wěn)定劑的不同選用不同的離心速度和離心時間。

用BSA做穩(wěn)定劑的膠體金—羊抗兔IgG結合物可先低速離心（20nm金膠粒用1 200r/min，5nm金膠粒用1 800r/min）20min，棄去凝聚的沉淀。然后將5nm膠體金結合物用6 000g，4℃離心1h；20nm～40nm膠體金結合物，14 000g，4℃離心1h。仔細吸出上清，沉淀物用含1％BSA的PB液（含0.02％NaN₃），將沉淀重懸為原體積的1／10，4℃保存。如在結合物內加50％甘油可貯存于-18℃保存一年以上。

為了得到顆粒均一的免疫金試劑，可將上述初步純化的結合物再進一步用10％～30％蔗糖或甘油進行密度梯度離心,分帶收集不同梯度的膠體金與蛋白的結合物。

（2）凝膠過濾法：此法只適用于以BSA作穩(wěn)定劑的膠體金蛋白結合物的純化。將膠體金蛋白結合物裝入透析袋，在硅膠中脫水濃縮至原體積的1／5～1／10。再經1 500r/min離心20min。取上清加至Sephacryl S-400（丙烯葡聚糖凝膠S-400）層析柱分別純化。層析柱為0.8 cm×20cm，加樣量為床體積的1／10，以0.02Mol/L PBS液洗脫（內含0.1％BSA，0.05％NaN₃，pH8.2者用IgG標記物），流速為8ml/h。按紅色深淺分管收集洗脫液。一般先濾出的液體為微黃色，有時略混濁，內含大顆粒聚合物等雜質。繼之為純化的膠體金蛋白結合物，隨濃度的增加而紅色逐漸加深，清亮透明，最后洗脫出略帶黃色的為標記的蛋白組分。將純化的膠體金蛋白結合物過濾除菌、分裝,4℃保存。最終可得到70％～80％的產量。

6．膠體金蛋白結合物的質量鑒定

（1）膠體金顆粒平均直徑的測量：用支持膜的鎳網（銅網也可）蘸取金標蛋白試劑，自然干燥后直接在透射電鏡下觀察。或用醋酸鈾復染后觀察。計算100個金顆粒的平均直徑。

（2）膠體金溶液的OD₅₂₀nm值測定：膠體金顆粒在波長510nm～550nm之間出現最大吸收值峰。用0.02Mol/L pH8.2 PBS液（含1％BSA，0.02％NaN₃）將膠體金蛋白試劑作1︰20稀釋，OD₅₂₀＝0.25左右。一般應用液的OD₅₂₀應為0.2～0.4。

（3）金標記蛋白的特異性與敏感性測定：采用微孔濾膜免疫金銀染色法（MF－IGSSA）。將可溶性抗原（或抗體）吸附于載體上（濾紙、硝酸纖維膜、微孔濾膜），用膠體金標記的抗體（或抗原）以直接或間接染色法并經銀顯影來檢測相應的抗原或抗體，對金標記蛋白的特異性和敏感性進行鑒定。