單克隆抗體制備技術

一、雜交瘤細胞的大量繁殖
克隆化的細胞可以在體外進行大量培養，收集上清液而獲得大量的單一的克隆化抗體。不過體外培養法得到的單克隆抗體有限，其不能超過特定的細胞濃度，且每天要換培養液。而體內雜交瘤細胞繁殖可以克服這些限制。雜交瘤細胞具有從親代淋巴細胞得來的腫瘤細胞的遺傳特性。如接種到組織相容性的同系小鼠或不能排斥雜交瘤的小鼠（無胸腺的裸鼠），雜交瘤細胞就開始無限地繁殖，直至宿主死亡。產生腫瘤細胞的小鼠腹水和血清中含有大量的雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體，這種抗體的效價往往高于培養細胞上清液的100~1 000倍。
利用免疫抑制劑，如降植烷、液體石蠟、抗淋巴細胞血清等，可以加速和促進腫瘤的生長。
1．材料
　　（1）經高壓滅菌的降植烷。
　　（2）Balb/c鼠：5~8周齡。
（3）雜交瘤細胞：取對數生長期的細胞。
（4）RPMI—1640培養液
（5）新生牛血清
2．操作方法
　　(1) 于小鼠腹腔注射0.5ml降植烷，注射后１～９周內種植細胞。
　　(2) 收取對數生長期的雜交瘤細胞，用５％FCS—1640液洗滌一次，1 000r/min離心10min。
(3) 取樣，用臺盼蘭染色，計活細胞數，重新用５％FCS—1640液配成1.0×107細胞/ml的懸液。
(4) 給注射了降植烷的小白鼠接種雜交瘤細胞，每只腹腔注射1ml（含1.0×107個細胞/ml）。
(5) 接種后10天左右時間腫瘤體積最大，此時可由腹腔抽取腹水，每隔1~3天取1次，可取10次。血清可由腋下動脈或心臟采血后分離。
二、單克隆抗體的提純
1．材料
(1) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl緩沖液
20 mMol/L NaCl
(2) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl緩沖液
40mMol/L NaCl
(3) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl緩沖液
80 mMol/L NaCl
(4) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl緩沖液
(5) 飽和硫酸銨液
(6) DEAE—纖維素柱
2．操作方法
（1）小鼠腹水用冷PBS液稀釋4倍后，于1.00×105轉離心30min，去沉淀。
（2）在4℃于上清中緩緩滴加飽和硫酸銨液，邊加邊攪拌，使溶液最終為50％硫酸銨濃度。
（3）此溶液置冰中30min~60min，然后5 000r/min離心10min，去上清。
（4）將沉淀溶于Tris－HCl緩沖液（40mMol/L NaCl）中（溶液可能混濁）。
（5）裝入透析袋于Tris－HCl緩沖液（20 mMol/L NaCl）中透析除鹽。
（6）離心去沉淀。
（7）溶液稀釋（1:100或更高倍稀釋）后，于280nm測蛋白含量，估計蛋白質含量
1A 280unit=0.8mg蛋白質
一般每ml腹水中，含有總蛋白約25mg~36mg。
（8）過DEAE—纖維素柱：纖維素柱高40cm，以20mMol/L NaCl Tris緩沖液平衡。透析樣品以Tris緩沖液等量稀釋。
樣品進入柱床速度為1ml~2ml/min，以NaCl線形梯度洗脫。大部分單克隆IgG于40 mMol/L和80mMol/L NaCl洗脫，也有極少例外的單克隆抗體于120 mMol/L ~150 mMol/L NaCl洗脫。
測OD280nm收集蛋白峰，單克隆IgG保存備用。
雜交瘤產生各種免疫球蛋白，但主要是IgG和IgM，究竟是哪種為主，則決定于抗原的免疫程序。免疫一次，且3天后就取脾，多為產生IgM的B淋巴細胞。免疫多次的多為IgG。
三、單克隆抗體的鑒定
1．雜交瘤細胞染色體的檢查 采用秋水仙素裂解法進行。
2．單克隆抗體的類型、亞型的測定：購買兔抗小鼠Ig類型和亞型的標準抗血清，采用瓊脂擴散法或ELISA夾心法測定單抗的Ig類型和亞型。
3．單抗的特異性鑒定 可以采用各種方法，如免疫熒光法、ELISA法、間接血凝和免疫印跡技術等，同時還需做免疫阻斷試驗等。
4．單抗的效價測定 可采用凝集反應、ELISA或放射免疫測定。不同的測定方法效價不同。培養上清液的效價遠不如腹水的效價。采用凝集反應，腹水效價可達5×104。而采用ELISA檢查，腹水效價可達1.0×106。單抗的效價以培養上清和腹水的稀釋度表示。
5．必要時還可以測定單抗的親和力和識別抗原表位的能力測定。