Dot－IGSS檢測牛結核血清抗體

（一）材料與試劑
1．抗原 牛結核PPD。
2．血清 待檢血清、標準結核陽性血清和結核陰性血清。
3．硝酸纖維膜 孔徑0.45µm。
4．氯化金（優質）
5．0.2Mol/L PB液
6．0.05Mol/L Tris—HCl緩沖液
7．硝酸銀顯影液（現用現配）
明膠（20g/L） 6.00ml
對苯二酚（57.90g/L） 3.00ml
硝酸銀（25g/L） 0.20ml
pH3.5檸檬酸鹽緩沖液 1.00ml
對苯二酚和硝酸銀溶液需避光保存，臨用前將明膠加熱溶解后，按上述比例依次混合。
pH3.5檸檬酸鹽緩沖液的配制：
檸檬酸（C6H8O7·H2O） 25.50g
檸檬酸三鈉（C6H5Na3·2H2O） 3.50g
去離子水 加至 100.00ml
溶解后即可使用。
8．定影液
硫代硫酸鈉（Na2S2O3） 20.0g
去離子水 加至 100.00ml
溶解即可。
9．兔抗牛IgG抗體。
（二）操作方法
1．膠體金的制備 試驗用水均要求三蒸餾水并過去離子柱，最終去離子水的電阻大于100萬Ω。所有容器最終均用去離子水清洗。
（1）采用鞣酸—枸櫞酸鈉還原法制備
A液 1％HAuCl4 2.00ml
去離子水 158.00ml
B液 1％枸櫞酸鈉 8.00ml
0.1％Mol/L K2CO3 0.20ml
1％鞣酸 0.20ml
去離子水 31.60ml
將A液和B液分別于60℃水浴30min，并不時攪拌，迅速將B液加入至A液中，攪拌，顏色為深藍色，繼續加熱至100℃，5 min～10min，溶液顏色變為深紅色，自然冷卻后4℃保存。
（2）膠體金鑒定：外觀呈深紅色、晶瑩透亮，迎著日光可見有光帶。電鏡觀察膠體金粒子大小平均為10nm，顆粒大小一致，分布均勻。
2．膠體金與兔抗牛IgG用量比例的確定 每ml膠體金所需的最低穩定蛋白量是30µg，根據試劑用量增加20％，所以每ml膠體金所需的最低穩定兔抗牛IgG量為36µg。
3．金標記兔抗牛IgG的制備 取所需量的兔抗牛IgG，加入少許去離子水，用0.1Mol/L K2CO3溶液調pH值為9.0（用精密pH試紙測定），同時膠體金溶液的pH值也調至9.0。在磁力攪拌下，將20ml膠體金溶液加入至兔抗牛IgG中，繼續攪拌10min，加入3.5ml 3％的聚乙二醇（分子量20 000）作為穩定劑，以使其最終濃度達到0.05％，再攪拌15min后，置4℃冰箱保存備用。
4．金標兔抗牛IgG的純化 將金標記的兔抗牛IgG以2 500r/min離心15min，以除去膠體金的聚合物，取上清以65 000g離心1h，可見離心物分為三層，上層為淡黃色，含有未結合的兔抗牛IgG，下層為近黑色，是尚未結合的膠體金顆粒,最主要的中間層為紅色，是結合良好的金標記的兔抗牛IgG，傾去上層，收集中層液，用含0.1％BSA的0.01Mol/L pH8.2PB混合至原體積的1／10，過濾除菌，分裝，4℃保存備用。
5．金標記兔抗牛IgG的鑒定
（1）顆粒大小及均勻度鑒定：取少許金標記的兔抗牛IgG，負染，電鏡觀察顆粒大小及均勻度，并測量粒子直徑大小。
（2）活性鑒定：將牛IgG點樣于硝酸纖維膜上，直接加金標兔抗牛IgG抗體，應顯示出明顯的粉紅色斑點。
6．正式試驗程序
（1）點樣 以打孔器將微孔濾膜制成直徑3mm的膜片。將牛結核PPD用0.01Mol/LpH9.0PBS液稀釋為40µg/ml，用微量加樣器加1µl抗原于膜片中央，37℃烘干10min。
（2）封閉 將膜片置于0.01Mol/L pH7.4含0.2％BSA的PBST液中，37℃作用45min，其間振蕩數次。取出后以蒸餾水洗滌1次，用濾紙吸干。
（3）加待檢血清 待檢血清以PBST液做1︰160倍稀釋。將膜片浸入其中，37℃作用1h，其間振蕩數次。取出后，以PBST液洗滌后，濾紙吸干。此步同時設標準陽性血清和陰性血清對照。
（4）加金標抗體 以PBST液將金標液作1︰10稀釋，將膜片浸入其中，37℃作用2h，中間振蕩數次。
（5）銀染 將膜片從金標液中取出，于去離子水洗滌3次，每次3min。然后將膜片浸入暗室中的銀染色液中，室溫下作用10min，移入定影液中，室溫作用5min。然后用去離子水沖洗，自然干燥后觀察結果。
（三）結果判定：
＋＋＋～＋＋＋＋ ：呈棕褐色或黑色斑點，著色深，均勻一致，與背景反差大。
＋＋ ：著色較深或著色很深，但背景色也較深。
＋ ： 著色淡，或著色較深，但有背景色。
－ ： 沒有著色，或與背景色沒有反差。
出現“ ”以上，判為陽性結果，否則判為陰性結果。