同位素原位雜交組化與免疫組化PAP法的聯合程序

　�。�1）切片入PBS沖洗5min，最好是將切片漂洗于滅菌器皿中。
　　（2）0.1mol/L 甘氨酸PBs 5min。
　�。�3）0.4%Triton X-100 PBS 15min。
　　（4）1μg/ml蛋白酶K，37℃保溫30min。
　�。�5）4%多聚甲醛PBS固定5min 。
　�。�6）PBS沖洗2×3min。
　　（7）0.25%乙酸酐（0.1mol/L 三乙醇胺配）10min。
　�。�8）2×SSC沖洗10min。
　�。�9）雜交：如是cDNA探針用前需進行變性處理，載片法時將切片在空氣中晾干，加含探針的雜交液10μl于切片上，蓋上22×22mm的硅化蓋片或相當大小看蠟膜，3H標記探針每10μl雜交液含1×105cpm探針，32P或35S標記探針每10μl雜交液含5×105cpm探針；如是漂浮切片，則用滅菌吸水紙將切片水份盡量吸干，然后入雜交液，探針濃度和載片法一樣。入雜交液后43℃保溫12～16h。
　�。�10）4×SSc 37℃沖洗10～30min。
　�。�11）2×SSC（如為RNA探針則含20μg/ml RNase）37℃沖洗30min。
　�。�12）1×SSC和0.1×SSc 37℃分別沖洗30min。
　　（13）PBS沖洗2×5min。（轉錄ISHH）
　�。�14）0.5%H2O2 PBS室溫30min。
　　（15）1%BSA 37℃，30min 。
　�。�16）第一抗體，4℃孵育16～24h。
　�。�17）PBS沖洗4×5min。
　�。�18）第二抗體37℃，1h。
　�。�19）PBS沖洗3×5min。
　�。�20）兔PAp 37℃，1h 。
　　（21）PBS沖洗3×5min。
　�。�22）DAB顯色液5～10min（DAB顯色液：0.05贐 0.03% H2O2 PBS液配）。
　�。�23）PBS沖洗3×5min。如是漂浮切片則將其貼于涂有粘附劑的載片上，晾干。
　�。�24）切片入70%，85%，95%和2個100%酒精脫水，空氣干燥。
　�。�25）在暗室涂布乳膠（乳膠配制：乳膠原液：0.6mol/L醋酸胺=1：1），晾干，裝入自顯影暗盒。
　�。�26）4℃曝光：3H標記探針4～8周，35S標記探針1～4周，32P標記探針7～10天。
　�。�27）D196顯影液，20℃顯影5～10min。
　　（28）自來水沖洗數秒。
　　（29）F5堅膜定影液10min。
　�。�30）自來水沖洗15min。
　　（31）切片溫箱烤干，脫水，透明，封片。