等密度離心分離樣品主要是根據(jù)被分離樣品的密度。在這種離心分離方法中，要用介質(zhì)產(chǎn)生一種密度梯度， 這種密度梯度覆蓋了待分離物質(zhì)的密度，這樣，通過離心使不同密度的顆粒懸浮到相應(yīng)的介質(zhì)密度區(qū)。在這種梯度離心中，顆粒的密度是影響最終位置的惟一因素，因此用這種方法分離顆粒，主要是根據(jù)被分離顆粒的密度差異。只要被分離顆粒間的密度差異大于1% 就可用此法分離。
蔗糖或者甘油(它們的最大密度是1.3g/cm3)通常可用于分離膜結(jié)合的細(xì)胞器，如高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體和線粒體。在等密度梯度離心中蔗糖或甘油的梯度的作用與移動區(qū)帶離心中梯度原理是不同的，在移動區(qū)帶離心中梯度的惟一目的是減少樣品的擴散， 即使是在離心管的底部，顆粒的密度也比介質(zhì)大。相反，在等密度梯度離心中，使用的密度是足以阻止顆粒移動的密度，當(dāng)顆粒達(dá)到與本身密度相同的密度區(qū)時就會停留在該區(qū)域。
離心分離密度大于1.3g/cm3的樣品，如DNA、RNA，需要使用密度比蔗糖和甘油大的介質(zhì)。重金屬鹽氯化銫(CsCl)是目前使用的最好的離心介質(zhì)，它在離心場中可自行調(diào)節(jié)形成濃度梯度，并能保持穩(wěn)定。在氯化銫形成的密度梯度中，離心管頂部的密度為:1.65g/cm3，底部為:1.75g/ cm3。因為DNA的密度是1.70g/ cm3，會停留在離心管的中部。