1. 吸除培養瓶內舊培養液。
2. 向瓶內加入胰蛋白酶和EDTA混合液少許，以能覆滿瓶底為限。
3. 置溫箱中2~5分鐘，當發現細胞質回縮，細胞間隙增大后，立即終止消化。
4. 吸除消化液，向瓶內注入Hanks液數毫升，輕輕轉動培養瓶，把殘余消化液沖掉。注意加Hanks液沖洗細胞時，動作要輕，以免把已松動的細胞沖掉流失，如用胰蛋白酶液單獨消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用Hanks液沖洗，直接加入培養液。
5. 用吸管吸取營養液輕輕反復吹打瓶壁細胞，使之從瓶壁脫離形成細胞懸液。
6. 計數板計數后，把細胞懸液分成等份分裝入數個培養瓶中，置溫箱中培養。