一、原理

生化需氧量是指在規(guī)定條件下，微生物分解存在于水中的某些可氧化物質，主要是有機物質所進行的生物化學過程中消耗溶解氧的量。分別測定水樣培養(yǎng)前的溶解氧含量和在20±1℃培養(yǎng)五天后的溶解氧含量，二者之差即為五日生化過程所消耗的氧量（BOD₅）。

二、儀器

1．恒溫培養(yǎng)箱。

2．5—20L細口玻璃瓶。

3．1000—2000mL量筒。

4．玻璃攪棒：棒長應比所用量筒高度長20cm。在棒的底端固定一個直徑比量筒直徑略小，并帶有幾個小孔的硬橡膠板。

5．溶解氧瓶：200—300mL，帶有磨口玻璃塞并具有供水封用的鐘形口。

6．虹吸管：供分取水樣和添加稀釋水用。

三、試劑

1．磷酸鹽緩沖溶液：將8.5g磷酸二氫鉀（KH₂PO₄），21.75g磷酸氫二鉀(K₂HPO₄)，33.4g磷酸氫二鈉(Na₂HPO₄·7H₂O)和1.7g氯化銨(NH₄Cl)溶于水中，稀釋至1000mL。此溶液的pH應為7.2。

2．硫酸鎂溶液：將22.5g硫酸鎂 (MgSO₄·7H₂O) 溶于水中，稀釋至1000mL。

3．氯化鈣溶液：將 27.5g無水氯化鈣溶于水，稀釋至1000mL。

4．氯化鐵溶液：將0.25g氯化鐵(FeCl₃·6H₂O)溶于水，稀釋至1000mL。

5．鹽酸溶液(0.5mol/L):將40mL(ρ=1.18g/mL)鹽酸溶于水中，稀釋至100mL。

6．氫氧化鈉溶液(0.5mol/L)：將20g氫氧化鈉溶于水，稀釋至1000mL。

7．亞硫酸鈉溶液(c_1/2Na2SO3=0.025mol/L)：將1.575g亞硫酸鈉溶于水，稀釋至1000mL。此溶液不穩(wěn)定，需每天配制。

8．葡萄糖-谷氨酸標準溶液：將葡萄糖(C₆H₁₂O₆)和谷氨酸(HOOC－CH₂－CH₂－CHNH₂－COOH)在103℃干燥1h，各稱取150mg溶于水中，移入1000mL容量瓶內(nèi)并稀釋至標線,混合均勻。此標準溶液臨用前配制。

9．稀釋水：在5—20L玻璃瓶內(nèi)裝入一定量的水，控制水溫在20℃左右。然后用無油空氣壓縮機或薄膜泵，將此水暴氣2—8h，使水中的溶解氧接近于飽和，也可以鼓入適量純氧。瓶口蓋以兩層經(jīng)洗滌晾干的紗布，置于20℃培養(yǎng)箱中放置數(shù)小時，使水中溶解氧含量達8mg/L左右。臨用前于每升水中加入氯化鈣溶液、氯化鐵溶液、硫酸鎂溶液、磷酸鹽緩沖溶液各1mL，并混合均勻。

稀釋水的PH值應為7.2，其BOD₅應小于0.2mg/L。

10．接種液：根據(jù)所取水樣用不同的方法獲取適用的接種液。

11．接種稀釋水：取適量接種液，加于稀釋水中，混勻。每升稀釋水中接種液加入量生活污水為1—10mL，表層土壤浸出液為20—30mL；河水、湖水為10—100mL。

接種稀釋水的pH值應為7.2，BOD₅值以在0.3—1.0mg/L之間為宜。接種稀釋水配制后應立即使用。

四、測定步驟

1．水樣的預處理

（1）水樣的pH值若超出6.5—7.5范圍時，可用鹽酸或氫氧化鈉稀溶液調(diào)節(jié)至近于7，但用量不要超過水樣體積的0.5%。若水樣的酸度或堿度很高，可改用高濃度的堿或酸液進行中和。

(2)水樣中含有銅、鉛、鋅、鎘、鉻、砷、氰等有毒物質時，可使用經(jīng)馴化的微生物接種液的稀釋水進行稀釋，或增大稀釋倍數(shù)，以減小毒物的濃度。

(3)含有少量游離氯的水樣，一般放置1—2h，游離氯即可消失。對于游離氯在短時間不能消散的水樣，可加入亞硫酸鈉溶液，以除去之。其加入量的計算方法是：取中和好的水樣100mL，加入1+1乙酸10mL，10%（m/V）碘化鉀溶液1mL,混勻。以淀粉溶液作指示劑，用亞硫酸鈉標準溶液滴定游離碘。根據(jù)亞硫酸鈉標準溶液消耗的體積及其濃度，計算水樣中所需加亞硫酸鈉溶液的量。

(4)從水溫較低的水域中采集的水樣，可遇到含有過飽和溶解氧，此時應將水樣迅速升溫至20℃左右，充分振搖，以趕出過飽和的溶解氧。

從水溫較高的水域或廢水排放口取得的水樣，則應迅速使其冷卻至20℃左右，并充分振搖，使與空氣中氧分壓接近平衡。

2．水樣的測定

（1）不經(jīng)稀釋水樣的測定：溶解氧含量較高、有機物含量較少的地面水，可不經(jīng)稀釋，而直接以虹吸法將約20℃的混勻水樣轉移至兩個溶解氧瓶內(nèi)，轉移過程中應注意不使其產(chǎn)生氣泡。以同樣的操作使兩個溶解氧瓶充滿水樣，加塞水封。

立即測定其中一瓶溶解氧。將另一瓶放入培養(yǎng)箱中，在20±1℃培養(yǎng)5d后。測其溶解氧。

（2）需經(jīng)稀釋水樣的測定

稀釋倍數(shù)的確定：地面水可由測得的高錳酸鹽指數(shù)乘以適當?shù)南禂?shù)求出稀釋倍數(shù)（見下表）。

工業(yè)廢水可由重鉻酸鉀法測得的COD值確定。通常需作三個稀釋比，即使用稀釋水時，由COD值分別乘以系數(shù)0.075、0.15、0.225，即獲得三個稀釋倍數(shù)；使用接種稀釋水時，則分別乘以0.075、0.15和0.25，獲得三個稀釋倍數(shù)。

稀釋倍數(shù)確定后按下法之一測定水樣。

①一般稀釋法：按照選定的稀釋比例，用虹吸法沿筒壁先引入部分稀釋水（或接種稀釋水）于1000mL量筒中，加入需要量的均勻水樣，再引入稀釋水（或接種稀釋水）至800mL，用帶膠板的玻璃棒小心上下攪勻。攪拌時勿 使攪棒的膠板露出水面，防止產(chǎn)生氣泡。

按不經(jīng)稀釋水樣的測定步驟，進行裝瓶，測定當天溶解氧和培養(yǎng)5d后的溶解氧含量。

另取兩個溶解氧瓶，用虹吸法裝滿稀釋水（或接種稀釋水）作為空白，分別測定5d前、后的溶解氧含量。

②直接稀釋法：直接稀釋法是在溶解氧瓶內(nèi)直接稀釋。在已知兩個容積相同（其差小于1mL）的溶解氧瓶內(nèi)，用虹吸法加入部分稀釋水（或接種稀釋水），再加入根據(jù)瓶容積和稀釋比例計算出的水樣量，然后引入稀釋水（或接種稀釋水）至剛好充滿，加塞，勿留氣泡于瓶內(nèi)。其余操作與上述稀釋法相同。

在BOD₅測定中，一般采用疊氮化鈉改良法測定溶解氧。如遇干擾物質，應根據(jù)具體情況采用其它測定法。溶解氧的測定法附后。

五、計算

1．不經(jīng)稀釋直接培養(yǎng)的水樣

BOD₅(mg/L)=c₁－c₂

式中：c₁——水樣在培養(yǎng)前的溶解氧濃度(mg/L);

c₂——水樣經(jīng)5d培養(yǎng)后，剩余溶解氧濃度(mg/L);

2．經(jīng)稀釋后培養(yǎng)的水樣                           

BOD₅(mg/L)=  ( (c₁–c₂)–(B₁–B₂)f₁)/f₂                   

式中：B1——稀釋水（或接種稀釋水）在培養(yǎng)前的溶解氧濃度(mg/L);

B2——稀釋水（或接種稀釋水）在培養(yǎng)后的溶解氧濃度(mg/L);

f₁——稀釋水（或接種稀釋水）在培養(yǎng)液中所占比例；

f₂——水樣在培養(yǎng)液中所占比例。

注意事項

1．測定一般水樣的BOD₅時，硝化作用很不明顯或根本不發(fā)生。但對于生物處理池出水，則含有大量硝化細菌。因此，在測定BOD₅時也包括了部分含氮化合物的需氧量。對于這種水樣，如只需測定有機物的需氧量，應加入硝化抑制劑，如丙烯基硫脲（ATU,C₄H₈N₂S）等。

2．在兩個或三個稀釋比的樣品中，凡消耗溶解氧大于2mg/L和剩余溶解氧大于1mg/L都有效，計算結果時，應取平均值。

3．為檢查稀釋水和接種液的質量，以及化驗人員的操作技術，可將20mL葡萄糖-谷氨酸標準溶液用接種稀釋水稀釋至1000mL，測其BOD₅，其結果應在180—230mg/L之間。否則，應檢查接種液、稀釋水或操作技術是否存在問題。

附：碘量法測定水中溶解氧

一、原理

水樣中加入硫酸錳和堿性碘化鉀，水中溶解氧將低價錳氧化成高價錳，生成四價錳的氫氧化物棕色沉淀。加酸后，氫氧化物沉淀溶解，并與碘離子反應而釋放出游離碘。以淀粉為指示劑，用硫代硫酸鈉標準溶液滴定釋放出的碘，據(jù)滴定溶液消耗量計算溶解氧含量。

二、試劑

1．硫酸錳溶液：稱取480g硫酸錳（MnSO₄·4H₂O）溶于水，用水稀釋至1000mL。此溶液加至酸化過的碘化鉀溶液中，遇淀粉不得產(chǎn)生藍色。

2．堿性碘化鉀溶液：稱取500g氫氧化鈉溶解于300—400mL水中；另稱取150g碘化鉀溶于200mL水中，待氫氧化鈉溶液冷卻后，將兩溶液合并，混勻，用水稀釋至1000mL。如有沉淀，則放置過夜后，傾出上層清液，貯于棕色瓶中，用橡皮塞塞緊，避光保存。此溶液酸化后，遇淀粉應不呈藍色。

3．1+5硫酸溶液。

4．1%（m/V）淀粉溶液：稱取1g可溶性淀粉，用少量水調(diào)成糊狀，再用剛煮沸的水稀釋至100mL。冷卻后，加入0.1g水楊酸或0.4g氯化鋅防腐。

5．0.02500mol/L(c_1/6K2Cr2O7)重鉻酸鉀標準溶液：稱取于105—110℃烘干2h，并冷卻的重鉻酸鉀1.2258g，溶于水，移入1000mL容量瓶中，用水稀釋至標線，搖勻。

6．硫代硫酸鈉溶液：稱取6.2g硫代硫酸鈉(Na₂S₂O₃·5H₂O)溶于煮沸放冷的水中，加入0.2g碳酸鈉，用水稀釋至1000mL，貯于棕色瓶中，使用前用0.02500mol/L重鉻酸鉀標準溶液標定。

7．硫酸（ρ=1.84g/cm³）

三、測定步驟

1．溶解氧的固定：用吸液管插入溶解氧瓶的液面下，加入1mL硫酸錳溶液，2mL堿性碘化鉀溶液，蓋好瓶塞，顛倒混合數(shù)次，靜置。一般在取樣現(xiàn)場固定。

2．打開瓶塞，立即用吸管插入液面下加入2.0mL硫酸。蓋好瓶塞，顛倒混合搖勻，至沉淀物全部溶解，放于暗處靜置5min。

3．吸取100mL上述溶液于250mL錐形瓶中，用硫代硫酸鈉標準溶液滴定至溶液呈淡黃色，加入1mL淀粉溶液，繼續(xù)滴定至藍色剛好退去，記錄硫代硫酸鈉溶液用量。

四、計算

 溶解氧(O₂,mg/L)=M·V×8×1000/100

式中：M——硫代硫酸鈉標準溶液的濃度(mol/L);

V——滴定消耗硫代硫酸鈉標準溶液體積(mL)。

注意事項

1．當水樣中含有亞硝酸鹽時會干擾測定，可加入疊氮化鈉使水中的亞硝酸鹽分解而消除干擾。其加入方法是預先將疊氮化鈉加入堿性碘化鉀溶液中。

2．如水樣中含Fe³⁺達100—200mg/L時，可加入1mL 40%氟化鉀溶液消除干擾。

3．如水樣中含氧化性物質（如游離氯等），應預先加入相當量的硫代硫酸鈉去除。